Непрямая проба кумбса положительная. Аутоимунные гемолитические анемии

Coombs test

Прямая проба Кумбса — антиглобулиновый тест (агглютинация в геле, позволяет выявить полные двухвалентные антитела), с помощью которого определяют антитела класса IgG и С3-компонент комплемента на поверхности эритроцитов. Обычно антитела, выявляемые прямой пробой Кумбса, имеют широкую специфичность, не ассоциированную с хорошо установленным антигеном. Положительная прямая проба Кумбса чётко указывает на наличие у больного гемолитической анемии, хотя не все больные с положительным прямым антиглобулиновым тестом страдают этим заболеванием. Приблизительно у 10% больных антитела или компоненты комплемента на мембране эритроцитов не удаётся определить прямой пробой Кумбса (тест отрицательный), но, тем не менее, они страдают аутоиммунной гемолитической анемией. Для уточнения специфичности антител в таких случаях используют тесты с их элюцией. Прямая проба Кумбса, положительная только к комплементу, обычно имеет отношение к холодовым антителам типа IgM. В этом случае антитела IgM не присутствуют на эритроцитах при базальной температуре тела. Однако вследствие того, что антитела IgM активно фиксируют комплемент, и комплемент остаётся на эритроцитах, при данной форме аутоиммунной гемолитической анемии (болезнь холодовых аггютининов) проба Кумбса будет положительна только к комплементу.

Прямая проба Кумбса положительна при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой тепловыми антителами, аутоиммунной лекарственной анемии (при приёме метилдопа до 20% больных имеют положительную реакцию), лекарственно-адсорбционном типе гемолитической анемии, иммунокомплексном типе гемолитической анемии (проба положительна только по отношению С3), при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой холодовыми антителами — болезни холодовых агглютининов (проба положительна только по отношению С3). При пароксизмальной холодовой гемоглобинурии прямая проба Кумбса отрицательная.
В остром периоде заболевания, в связи с разрушением эритроцитов, на которых фиксировалось большое количество антител, при гемолитическом кризе, а также при недостаточном количестве антител при хроническом течении болезни может отмечаться отрицательная прямая проба Кумбса.

:

Важным условием обеспечения качества лабораторного исследования крови является взятие материала натощак, в утреннее время (до 12:00).
За 12 часов до исследования следует исключить прием алкоголя, курение, прием пищи, ограничить физическую активность.
Утром в день взятия крови на исследование можно выпить воду.
Исключить прием лекарств; если отменить прием лекарств невозможно, необходимо проинформировать об этом лабораторию.
Взятие материала желательно проводить до проведения любых медицинских диагностических манипуляций.
При оценке уровня гормонов у женщин важно учитывать день менструального цикла, когда наиболее оптимально определять некоторые гормоны. Эту информацию Вы можете получить у лечащего доктора.

Показатель	Характеристика
Анализатор и тест-система	Гелевые карты; DiaMed AG (Швейцария)
Референтные значения	Отрицательный результат / Положительный результат
Интерферирующие факторы. Медикаменты
Возможна положительная проба при приёме следующих медикаментов: ацетаминофен, салициловая кислота, аминопирин, антигистаминные препараты, карбромал, цефалоспорины, хлорпромазин, хлорпропамид, цисплатин, клонидин, дипирон, этосуксимид, фенфлюрамин, фуадин, гидралазин, гидрохлортиазид, ибупрофен, инсулин, изониазид, леводопа, мефенаминовая кислота, мелфалан, метадон, метилдопа, метилсергид, номифензин, пеницилламин, пенициллины, фенацетин, фенилбутазон, пробенецид, прокаинамид, хинидин, хинин, рифампин, стрептомицин, сульфонамиды, производные сульфонилмочевины, тетрациклин, триамтерен, тримеллитовый ангидрид
Показания к назначению
Диагностика иммунной гемолитической анемии, гемолитической болезни новорожденных, лекарственной иммунной гемолитической анемии, гемолитических трансфузионных реакций
Интерпретация результатов
В норме прямая проба Кумбса -- отрицательная. Положительная проба Кумбса при: аутоиммунной гемолитической анемии; гемолитической болезни новорожденных; лекарственной иммунной гемолитической анемии; гемолитических трансфузионных реакциях

В последние годы среди пациентов различного возраста увеличилось количество заболеваний крови и для их диагностики используются различные методы и средства. Проба Кумбса является клиническим исследованием крови, и цель ее проведения заключается в выявлении в организме определенных , представляющих угрозу для здоровья человека.

Может произойти приклеивание антител к и результатом этого может стать нарушение состояния иммунной системы. Прямая проба Кумбса представляет собой антиглобулиновый тест, который проводится для выявления антител, прикрепившихся к поверхности эритроцитов.

Обычно специалисты прибегают к проведению теста на антитела в следующих ситуациях:

Необходимость переливания крови. Из курса школьной анатомии известно, что у человека может быть одна из четырех групп крови. Проведение антиглобулинового теста позволяет определить возможность переливания крови в другой организм. Говорить о том, что пациент может стать донором для переливания можно лишь в том случае, если его кровь соответствует типу больного, то есть в ней присутствуют одинаковые антигены. В том случае, если у пациента и донора существует различие антигенов, то это может привести к тому, что произойдет разрушение иммунной системой перелитых клеток. Результатом этого может стать развитие тяжелых заболеваний и осложнений, и даже летальный исход. Именно по этой причине важную роль придается поиску нужного типа крови при появлении необходимости ее переливания.
Определение риска резус-сенсибилизации. Современная медицина определяет резус как антиген, а его полным определением является понятие «резус-фактор». Благодаря тесту Кумбса удается диагностировать присутствие антител к резус-фактору в крови женщин во время . В том случае, если будущая мамочка имеет отрицательный резус-фактор, а отец положительный, то будущий ребенок может унаследовать любой из них. При выявлении у будущего ребенка положительного резус-фактора повышается опасность развития резус-сенсибилизации — это процесс смешения крови и матери во время беременности или родовой деятельности.

В том случае, если наблюдается несовместимость группы матери и ребенка, то иммунная система женского организма начинает воспринимать плод как чужеродный предмет и оказывает на него всевозможную атаку. Результатом этого может стать развитие тяжелой патологии у ребенка, которая получила название эритробластоза. В некоторых случаях при отсутствии эффективного лечения наблюдается гибель плода в утробе матери либо сразу же после его рождения.

В некоторых случаях проба Кумбса проводится с целью выявления аутоиммунной гемолитической .

Такое заболевание встречается довольно редко и проявляется в образовании к антигенам эритроцитов своего собственного организма.

Специалисты выделяют две разновидности проб Кумбса, каждая из которых применяется для определенных целей.

Прямая проба. Прямая проба в медицинской практике еще называется прямой антиглобулиновый тест и с его помощью удается диагностировать антитела, прикрепленные к поверхности . В некоторых случаях производство таких антител в организме человека происходит как результат прогрессирования различных либо приема таких лекарственных препаратов, как:

Хинидин
Метилдоп
Прокаинамид

Опасность таких антител кроется в том, что они могут становиться причиной развития и оказывать разрушающее воздействие на . Иногда к проведению теста Кумбса прибегают в том случае, когда необходимо выявить причины развития таких патологий, как анемия и .

У нормой считается отрицательная реакция пробы Кумбса.

Непрямая проба. Часто специалисты прибегают к проведению непрямой пробы Кумбса, которая имеет второе название «непрямой антиглобулиновый тест». Основной целью такого является выявление антител к эритроцитам, которые присутствуют в сыворотке крови. Благодаря такой пробе удается определить, совпадает ли кровь донора с кровью пациента при необходимости ее переливания. Такой анализ является своеобразной пробой на совместимость и благодаря его проведению удается избежать развития неблагоприятной реакции на донорскую кровь.

Обычно такое исследование рекомендуется проходить женщинам во время . У некоторых мамочек в организме могут присутствовать антитела определенного класса, способные проникать через плаценту в кровь будущего ребенка. Результатом такого процесса может стать гемолитическая болезнь плода, а также развитие различных во время беременности.

Подготовка к процедуре и ее проведение

Обычно к проведению процедуры не требуется какая-либо специальная подготовка, а провести можно совершенно в любое время.

Подготовка к диагностике включает в себя следующие моменты:

в том случае, если анализ будет проводиться у новорожденного, то родителям следует объяснить, что с его помощью удастся диагностировать гемолитическое заболевание
при присутствии подозрения на развитие у пациента гемолитической болезни ему необходимо разъяснить, что проведение такого анализа поможет определить причины ее развития
подготовка к анализу не требует каких-либо ограничений в еде и режиме питания
при проведении анализа у новорожденного, следует сообщить родителям о том, что понадобится забор крови из вены, а также уточнить время проведения процедуры
необходимо известить пациента о том, что во время наложения жгута и забора крови могут возникать неприятные ощущения
прием лекарственных препаратов может искажать результаты пробы Кумбса, поэтому за некоторое время до ее проведения их следует отменить

При проведении прямой пробы Кумбса из вены с помощью шприца берется кровь. Перед началом проведения процедуры выполняется тщательная дезинфекция места прокола, а после забора материала для исследования налаживается вата либо стерильная марля. В том случае, если анализ проводится у новорожденных, то кровь берется из пуповины.

При появлении гематомы после забора крови назначается прилаживание согревающих компрессов на место прокола. После проведения процедуры пациент может возобновить прием лекарственных препаратов.

В лаборатории проводится очищение полученной крови и параллельно с этим выполняется отделение красных кровяных телец.

Специалистом проводиться исследование образца с использованием различных реагентов сыворотки и Кумбса, противопоставляемых глобулину человека. В том случае если не происходит слипания эритроцитов и не развивается агглютинации, то можно говорить о положительном результате.

Во время проведения могут возникать следующие осложнения:

развитие из места забора крови во время исследования
головная боль, головокружения либо обморок
развитие кровоизлияния под кожные покровы
при плохой антимикробной обработке кожных покровов в месте инъекции повышается риск проникновения инфекции в организм

Результаты исследования

Расшифровка — возможные заболевания

У здорового человека в организме отсутствуют антитела к , то есть в норме их не должно быть. В том случае, если проведенное исследование покажет положительную пробу, то это может обозначать присутствие в организме антител на красных кровяных клетках.

Результатом такого патологического состояния может стать разрушение эритроцитов, и обычно оно развивается:

при системной
при микоплазменной инфекции
при инфекционном мононуклеозе
при гемолитическом заболевании новорожденных
при медикаментозной гемолитической анемии
при лимфолейкозе хронического характера
при аутоиммунной гемолитической анемии
при несовместимости крови плода и матери

Прямая проба Кумбса часто назначается женщинам во время беременности для определения совместимости крови матери и плода. В том случае, если наблюдается несовместимость материнского организма и будущего ребенка по эритроцитарным агентам, то повышается опасность развития гемолитического заболевания новорожденного.

Резус-положительный ребенок у резус-отрицательной женщины становится причиной развития резус-конфликта.

При такой патологии происходит разрушение эритроцитов будущего ребенка антирезусными телами материнского организма. Попадая в женский организм, красные кровяные тельца плода оказывают стимулирующее действие на иммунную систему матери, и результатом этого становится производство антител к ребенку.

Полезное видео — гемолитические анемии.

Образование в материнском организме таких приводит к агглютинационному тромбозу капилляров и ишемическому некрозу плодных тканей. В результате гемолиза эритроцитов и распада гемоглобина наблюдается образование токсического непрямого в организме плода. Резкое снижение содержания эритроцитов у плода по причине их гемолиз приводит к развитию у ребенка такого заболевания, как анемия.

Низкий уровень и высокая концентрация билирубина значительно осложняют течение болезни. Во время беременности диагностируется множество таких осложнений как:

угроза выкидыша
развитие кровотечения
гестозы
малокровие
преждевременная родовая деятельность

Антирезусные тела защищают мать, но в то же время представляют серьезную угрозу для развивающегося плода. Благодаря проведению пробы Кумбса удается вовремя диагностировать такое патологическое состояние женского организма и назначить своевременное лечение. Кроме этого, такой анализ помогает выявлять различные заболевания крови, прогрессирование которых могут привести к смерти пациента.

Проба Кумбса - это специфический лабораторный тест, который позволяет определить антитела, находящиеся в или на поверхности эритроцита. Данная процедура позволяет диагностировать иммунную в том числе у новорожденных, а также выявить гемолитические трансфузионные реакции. Проба Кумбса активно применяется в судебной медицине и научной генетике с целью определения эритроцитарных антигенов. Соблюдение всех правил осуществления такого анализа позволяет получить максимально достоверный результат.

Цель антиглобулинового теста

Проба Кумбса прямая позволяет обнаружить антиэритроцитарные антитела, которые фиксируются на эритроцитах. Положительная реакция при подобном исследовании указывает на развитие аутоиммунной Следует отметить, что отрицательный результат не исключает наличия поскольку антитела нередко находятся в свободном виде, то есть не имеют связи с эритроцитами. В таких случаях целесообразно провести непрямую пробу Кумбса, которая позволит определить автономные вещества в

Как проводится анализ?

абор венозной крови у пациента осуществляют утром натощак, несмотря на то, что каких-либо существенных факторов, влияющих на конечный результат подобного теста, не обнаружено. Хранить взятый материал разрешается при температуре от 2 до 8 °С не дольше семи дней. Для того чтобы показатели данного исследования были максимально точны, цельную кровь в течение первых двух часов необходимо доставить в лабораторию. В идеале проба Кумбса должна показывать отрицательный результат, что указывает на отсутствие гемолитических изменений в организме.

Расшифровка итоговых показателей

Проба Кумбса является достаточно трудоемким методом исследования, который требует тщательного и точного выполнения. При использовании такого теста могут встречаться некоторые сложности, которые связаны с неправильной интерпретацией окончательных результатов по причине слабого проявления положительных реакций. Следует отметить, что недостоверность анализа - а именно положительная проба Кумбса - может стать следствием неэффективной отмывки эритроцитов, контакта с жирной
поверхностью, а также нейтрализации антиглобулиновых реагентов компонентами

сыворотки. Еще одним недостатком такого метода исследования является нестойкость взятого материала, хранение которого имеет определенные особенности.

Причиной ложноотрицательного результата может стать чрезмерное встряхивание взвеси эритроцитов при ресуспендировании. Ошибочные результаты могут быть также обусловлены присутствием примесей антикомплементарных антител, которые адсорбируются при инкубации на поверхности тестируемых эритроцитов, в результате чего создается видимость положительного результата. Если тщательно отмывать исследуемые образцы и контролировать условия проведения реакции, указанные недостатки могут быть легко устранены, что повысит шансы на получение максимально достоверных показателей пробы Кумбса.

Антитела , находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии вплазме крови . В зависимости от состояния антител проводится прямая или непрямая реакция Кумбса. Если есть основания для предположения, что антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап - добавляетсяантиглобулиновая сыворотка . Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходитагглютинация эритроцитов.

Непрямая реакция

Непрямая реакция Кумбса протекает в 2 этапа. Сначала необходимо искусственно осуществить сенсибилизацию эритроцитов. Для этого эритроциты и исследуемую сыворотку крови инкубируют, что вызывает фиксацию антител на поверхности эритроцитов. После чего проводится второй этап теста Кумбса - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция преципитации - РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом . Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

Реакция кольцепреципитации . Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата . Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони . Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.
Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммуннук сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте "встречи" с антигеном линии преципитации.
Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. f1оecus - хлопья шерсти) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин - антитоксин или анатоксин - антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса. Это образование включает в себя область генов на 6-й хромосоме, которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного ответа.

Задачи при HLA типировании могут стоять самые разные - биологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами), определение предрасположенности к различным заболеваниям, подбор доноров для пересадки органов - при этом производится сравнение результатов HLA типирования тканей донора и реципиента. С помощью HLA типирования определяют, и насколько супруги сходны или различимы по антигенам тканевой совместимости, чтобы диагностировать случаи бесплодия.

HLA типирование предполагает анализ полиморфизма HLA и проводится двумя методами - серологическим и молекулярно-генетическим. Классический серологический метод HLA типирования основан на микролимфоцитотоксическом тесте, а молекулярный метод использует проведение ПЦР (полимеразную цепную реакцию).

Серологическое HLA типирование проводится на выделенных клеточных популяциях. Антигены главного комплекса гистосовместимости несут на себе в основном лимфоциты. Поэтому суспензию Т лимфоцитов используют в качестве основных носителей антигенов I класса, и суспензию В лимфоцитов для определения антигенов HLA II класса. Для выделения необходимых клеточных популяций из цельной крови используют либо центрифугирование, либо иммуномагнитную сепарацию. Считается, что первый способ может привести к ложноположительным данным, так как при этом происходит гибель части клеток. Второй способ признан более специфичным - при этом более 95% клеток остаются жизнеспособными.

Но основой постановки лимфоцитотоксического теста HLA типирования является специфическая сыворотка, содержащая антитела к различным аллельным вариантам антигенов HLA I и II классов. Серологический тест позволяет определить HLA-тип путем изучения того, какие из сывороток реагируют с лимфоцитами, а какие - нет.

Если между клетками и сывороткой происходит реакция, в результате на поверхности клетки образуется комплекс антиген-антитело. После добавления раствора, содержащего комплемент, происходит лизис и гибель клетки. Оценивают серологический тест HLA типирования с помощью флуоресцентной микроскопии по оценке позитивной (красная флуоресценция) и негативной (зеленая флуоресценция) реакций, или фазово-контрастной микроскопии по окраске ядер погибших клеток. Результат HLA типирования выводят с учетом специфичности прореагировавших сывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов, интенсивности реакции цитотоксичности.

Недостатками серологического HLA типирования являются наличие перекрестных реакций, слабое сродство антител или низкая экспрессия HLA-антигенов, отсутствие белковых продуктов у ряда HLA-генов.

Более современные, молекулярные методы HLA типирования используют уже стандартизованные синтетические образцы, которые реагируют не с антигенами на поверхности лейкоцитов, а с ДНК и прямо указывают на то, какие антигены присутствуют в пробе. Молекулярные методы не требуют живых лейкоцитов, любая человеческая клетка может быть подвержена изучению, и для работы достаточно несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки рта.

Молекулярно-генетическое HLA типирование использует метод ПЦР, первым этапом которой является получение чистой геномной ДНК (из цельной крови, лейкоцитарной суспензии, тканей).

Затем образец ДНК копируется - амплифицируется в пробирке с использованием праймеров (коротких одноцепочечных ДНК), специфичных к определенному HLA -локусу. Концы каждого из пары праймеров должны быть строго комплементарны уникальной последовательности, соответствующей конкретному аллелю, в противном случае амплификация не осуществляется.

После ПЦР, в ходе многократного копирования, получается большое количество фрагментов ДНК, которое можно оценить визуально. Для этого реакционные смеси подвергают электролизу или гибридизации, и определяют, произошла ли специфическая амплификация, при помощи программы или таблицы. Результат HLA типирования представляется в форме всестороннего отчета на генном и аллельном уровнях. Из-за стандартизованности используемых образцов, молекулярное HLA типирование точнее серологического. Кроме того, оно дает больше информации (больше новых аллелей ДНК) и более высокий уровень ее детализации, поскольку позволяет идентифицировать не только антигены, но и сами аллели, обуславливающие, какой именно антиген присутствует на клетке.

Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов).

Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирую-щих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент.

Иммунофлюоресцентный метод

(РИФ, реакция иммунофлюоресценции) - метод выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-д-ки инфекц. заболеваний (идентификация возбудителя в иссл. материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямой И. м. состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной к-ры с-кой, содержащей специфические Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и рассматривают в люминесцентный микроскоп. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. Принепрямом. И. м. на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующей специфической с-кой, на втором -люминесцирующей с-кой против-глобулинов того животного, с-ка к-рого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод). Кроме люминесцентного микроскопа для учета РИФ при фенотипировании клеток применяютлазерный сортировщик клеток .

Проточная цитометрия - метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).

интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Реакция Кумбса - эффективный метод выявления антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител крови человека в непрямой реакции агглютинации. Основа теста - использование при типировании антигенов эритроцитов специфических моноклональных реагентов на основе иммуноглобулинов класса G (IgG) с последующим применением на втором этапе реакции антиглобулиновой сыворотки Кумбса (АГС).

АГС производится путем смешивания сыворотки из крови лабораторных животных, иммунизированных иммуноглобулинами класса G человека, и моноклональных антител к одному из компонентов - C3D комплементу сыворотки человека. АГС вызывает агглютинацию эритроцитов, сенсибилизированных специфическими антителами. При отсутствии антител на эритроцитах под воздействием АГС положительная реакция не происходит.

Непрямая реакция Кумбса позволяет определить наличие:

антигенов эритроцитов, выявляемых IgG-реагентами («неполными» антителами, например, моноклональными реагентами анти-D, анти-F Y a , анти-F Y b);
антиэритроцитарных антител класса IgG.

Непрямой антиглобулиновый тест: выявление антигенов эритроцитов

Приводим методику непрямой реакции Кумбса на примере цоликлона анти-D IgG.

Промаркируйте чистую пробирку: укажите ФИО исследуемого лица.
Внесите в пробирку 2 капли (приблизительно 0,1 мл) цоликлона анти-D IgG.
Добавьте 2 капли 5 % взвеси предварительно отмытых физиологическим раствором анализируемых эритроцитов. Смешайте исследуемые образцы с цоликлоном.
Инкубируйте смесь на водяной бане или в термостате при 37 °С на протяжении 30 минут.
Добавьте в пробирку пастеровской пипеткой 5 - 10 мл физраствора.
Центрифугируйте пробирку с центробежным ускорением 1200 g при 18 - 25 °С на протяжении одной минуты.
Удалите физраствор.
Повторно проведите процедуру отмывки эритроцитов с помощью центрифугирования еще 2 - 3 раза.
Добавьте 2 капли антиглобулиновой сыворотки к осадку кровяных телец, выполните перемешивание.
Центрифугируйте пробирку с центробежным ускорением 1200 g в течение минуты при температуре 18 - 25 °С.
Добавьте с помощью дозатора или пастеровской пипетки 3 - 5 капель физраствора.
Ресуспендируйте осадок и визуально оцените наличие агглютинации. Выраженные агглютинаты на дне пробирки на фоне прозрачного раствора свидетельствуют об обнаружении антигена эритроцитов. Непрозрачная суспензия кровяных телец говорит об отсутствии антигена.

Реакция Кумбса: скрининг изоиммунных антиэритроцитарных антител

Исследование осуществляется в рамках проведения пробы на индивидуальную совместимость по всем антигенам эритроцитов крови донора и реципиента. Заключение о полной совместимости сыворотки реципиента с эритроцитами донора производят на основании отсутствия гемолиза и/или агглютинации на всех этапах проведения анализа. Признаки гемолиза и/или агглютинации на каком-либо этапе тестирования говорят о несовместимости образцов крови.

Оценка совместимости по системе АВ0, обнаружение «холодовых» антител

Приготовьте образец крови донора:
- внесите в пробирку автоматическим дозатором 0,2 мл крови;
- 3 раза отмойте эритроциты в 5,0 мл физиологического раствора;
- ресуспендируйте осадок в 3 - 4 мл раствора с низкой ионной силой LISS.
Промаркируйте вторую чистую пробирку: укажите ФИО реципиента и ФИО донора.
Внесите автоматическим дозатором 0,1 мл сыворотки реципиента в промаркированную пробирку.
Добавьте 2 капли 5 % суспензии эритроцитов в растворе LISS.
Без промедления центрифугируйте смесь с центробежным ускорением 1200 g при температуре 18 - 25 °С на протяжении 15 - 20 секунд.
Легким покачиванием пробирки отделите осадок от дна. Оцените наличие агглютинатов. Присутствие гемолиза и/или агглютинатов означает:
- несовместимость по системе АВ0;
- наличие в сыворотке больного «холодовых» антител класса IgM или IgА, не специфичных к антигенам АВ0.

Выявление «тепловых» антител

При отсутствии гемолиза и/или агглютинатов инкубируйте пробирку 10 - 15 минут при 37 °С.
Центрифугируйте пробирку при 1200 g на протяжении 15 - 20 секунд при комнатной температуре.
Встряхните пробирку и проверьте наличие гемолиза и/или агглютинатов в супернатанте. Положительный результат говорит об обнаружении в сыворотке больного «тепловых» IgM-антител против антигенов эритроцитов донора.

Обнаружение IgG-антител в тесте Кумбса

При отрицательном результате на прошлом этапе исследования добавьте в пробирку пастеровской пипеткой 5 мл 0,9 % раствора NaCl.
Центрифугируйте пробирку при 1200 g на протяжении 15 - 20 секунд при температуре воздуха 18 - 25 °С. Пастеровской пипеткой аккуратно избавьтесь от супернатанта.
Повторно выполните отмывание эритроцитов еще 2 - 3 раза.
Добавьте в пробирку 1 - 2 капли антиглобулиновой сыворотки. Выполните тщательное перемешивание.
Центрифугируйте пробирку при 1200 g 15 - 20 секунд.
Аккуратно разбейте осадок эритроцитов и проведите визуальную оценку результата реакции. Выявление агглютинации означает присутствие в сыворотке больного IgG-антител против антигенов эритроцитов донора.